Katedra i Zakład Biologii i Genetyki Wydz. Farm. ŚIAM, Oddział Leczenia Oparzeń, Szpital Miejski Nr 2, Siemianowice Śląskie, Pracownia Diagnostyki Izotopowej, Instytut Medycyny Pracy i Zdrowia Środowiskowego, Zakład Diagnostyki Laboratoryjnej, Instytut Medycyny Pracy i Zdrowia Środowiskowego, Katedra i Zakład Fizjologii Wydziału Farmacji ŚIAM.

Grasica jest centralnym narządem układu immunologicznego, a nabłonkowe komórki jej zrębu produkują wiele aktywnych substancji odpowiedzialnych za procesy limfogenezy i immunogenezy. Substancje te mają budowę polipeptydów, a do lepiej poznanych należą tymozyna, tymopoetyna, tymulina (grasiczy czynnik surowiczy), grasiczy czynnik humoralny, hormon stymulujący limfocyty, homeostatyczny hormon grasiczy, hipokalcemiczny czynnik grasicy, grasiczy czynnik X (TFX). W chwili obecnej preparaty z dojrzałych grasic znalazły zastosowanie w leczeniu wielu chorób spowodowanych niedoborami immunologicznymi o różnej etiologii.1-3

Poza działaniem na układ immunologiczny substancje humoraine grasic działają także na liczne pozaimmunologiczne procesy w ustroju. (5-7, 10) Badania Czaplickiego i wsp. dowodzą, że preparaty z dojrzałych grasic wykazują regeneracyjny, odmłodzeniowy wpływ na wiele komórek, tkanek i narządów organizmu, takich jak tkanka nabłonkowa, tkanka łączna, krew, narządy miąższowe (wątroba, nerki, śledziona), a nawet ośrodkowy układ nerwowy.

Uwzględniając wyżej przytoczone efekty działania preparatów z dojrzałych grasic podjęto próbę oceny zastosowania preparatu TFX u ciężko oparzonych pacjentów przebywających w Oddziale Leczenia Oparzeń Szpitala Nr 2 w Siemianowicach Śląskich.

Materiał i metody

Badania przeprowadzono w okresie od 15.05.1996 r. do 30.05.1997 r. Zakwalifikowano do nich 80 pacjentów w wieku od 18 do 60 lat z oparzeniami II° i III° obejmującymi od 20 do 60% ogólnej powierzchni ciała. Ciężkość oparzenia określano w jednostkach oparzeniowych BUS (tabela l). W ocenie brano pod uwagę następujące parametry: stan kliniczny pacjentów z uwzględnieniem występowania zakażeń ran oparzeniowych i posocznic; stężenie mioglobiny w surowicy krwi; stężenie immunoglobulin w surowicy krwi; całkowite stężenie czynników przeciwutleniających w surowicy krwi; aktywność katalazy i peroksydazy glutationowej w erytrocytach krwi obwodowej.

Z badań wyłączono ludzi chorych na cukrzycę. Grupę kontrolną (K) stanowiło 40 osób oparzonych, przyjmowanych do szpitala w dni parzyste, u których stosowano standardowe metody leczenia oparzeń. Grupę badaną (E) utworzono z 40 pacjentów przyjmowanych na leczenie w dni nieparzyste; u tych chorych do standardowej terapii oparzeń dodano preparat z dojrzalej grasicy TFX. Preparat był stosowany przez 14 dni w postaci dwóch iniekcji domięśniowych na dobę po 10 mg podawanych rano i wieczorem. Przez kolejne 14 dni preparat TFX podawano jeden raz dziennie w iniekcji domięśniowej.

U pacjentów z obu grup postępowanie kliniczne, zarówno ogólne, jak i miejscowe, prowadzono w ten sam sposób. Polegało ono na tym, że po uzupełnieniu deficytu
płynów, niedoboru elektrolitów, białek i wyprowadzeniu ze wstrząsu wykonywano demarkację martwiczych tkanek i, gdy było to konieczne, pokrywano ranę wolnymi
przeszczepami skóry o pośredniej grubości.

Dodatkowo wykonano badania u 12 osób nieoparzonych (grupa Z).

Wymazy z ran oparzeniowych pobierano w dniu przyjęcia chorego i po upływie tygodnia od dnia oparzenia. W razie konieczności pobierano także krew do badań bakteriologicznych. Wzrost drobnoustrojów obserwowano po 24 i 48 godzinach inkubacji. Antybiogram wykonywano metodą krążkowo-dyfuzyjną Mueller-Hintona.

Krew do badań immunologicznych i enzymatycznych pobierano w dniu oparzenia, a następnie w 7, 14, 21 i 28 dobie po oparzeniu. Oznaczano stężenie w surowicy krwi immunoglobulin klasy IgG, IgA, IgM wykorzystując metodę turbidymetryczną z użyciem odpowiednich surowic monoklonalnych. Oznaczano również metodą kalorymetryczną całkowite stężenie w surowicy krwi czynników przeciwutleniających. Stężenie mioglobiny w surowicy krwi określano stosując metodę radioimmunologiczną. Aktywność peroksydazy glutationowej w erytrocytach określono wykorzystując zestaw RANDOX, a aktywność katalazy w krwinkach czerwonych oznaczano metodą Aebi. Uzyskane wyniki aktywności obu enzymów przeliczano na gram hemoglobiny (U/gHb).

Wartości oznaczanych parametrów ilustrują ryciny 1-7. (w krótce w załączeniu) Symbol liczbowy przy nazwie grupy (grupa badana - E, grupa kontrolna - K) mówi, którego dnia były pobrane odpowiednie próbki krwi.

Uzyskane wyniki opracowano statystycznie stosując test chi-kwadrat dla oceny parametrów klinicznych, a test t-Studenta dla oceny parametrów immunologicznych i enzymatycznych. Przyjęto poziom istotności statystycznej 0,05.

Wyniki

Ocenę wyników klinicznych leczenia oparzonych pacjentów z obu grup przedstawia tabela 2.

Zakażenie głębokich ran oparzeniowych florą bakteryjną stwierdzono u wszystkich pacjentów zarówno z grupy kontrolnej, jak i z grupy badanej. Najczęściej izolowanymi drobnoustrojami były:

Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus epidermidis, Acinetobacter sp., Proteus mirabilis, Streptococcus sp., Escherichia blattae i KIebsiella sp. Nie stwierdzono istotnych różnic w częstości występowania poszczególnych rodzajów bakterii w zakażonych ranach pacjentów z obu badanych grup.

Skrócenie czasu epitelializacji ran powierzchownych u chorych grupy badanej w porównaniu z grupą kontrolną nie było statystycznie istotne, natomiast skrócenie czasu gojenia ran głębokich u tych pacjentów wykazało statystyczną znamienność.

Wśród chorych grupy kontrolnej bakteriemia wystąpiła w 17 przypadkach, a wśród pacjentów, którym podawano dodatkowo preparat TFX, w 12. Analiza porównawcza tych wyników nie wykazała statystycznie istotnych różnic.

U pacjentów obu badanych grup stwierdzono występowanie objawów klinicznych charakterystycznych dla posocznicy. Objawy kliniczne potwierdzone zostały wynikami badań laboratoryjnych i badań bakteriologicznych. Wśród pacjentów grupy kontrolnej posocznica rozwinęła się w 11 przypadkach, wśród chorych z grupy badanych - tylko w 4. Stwierdzone posocznice zostały wywołane przez następujące gatunki bakterii: Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter sp., Enterococcus
faecalis, Klebsiella pneumoniae.

W grupie pacjentów badanych posocznica gronkowcowa rozwinęła się w czterech przypadkach; w jednym przypadku była wywołana przez Pseudomonas aeruginosa
- pacjent zmarł z objawami niewydolności wielonarządowej. U pacjentów grupy kontrolnej wystąpiła większa liczba posocznic. Ośmiu chorych zmarło z powodu posocznicy, w czterech przypadkach wywołanej przez Staphylococcus aureus, w trzech przez Pseudomonas aeruginosa i w jednym przez Acenetobacter sp. U wszystkich chorych wystąpiły objawy niewydolności wielonarządowej.

Różnica w występowaniu posocznic i zgonów spowodowanych posocznicą w obu grupach jest statystycznie istotna.

Stężenie mioglobiny w surowicy krwi
Stężenie mioglobiny w surowicy osób zdrowych określone metodą radioimmunologiczną wynosi 5-65 ng/ml.

U chorych w dniu oparzenia średnie stężenie mioglobiny w surowicy krwi wynosiło 813,6 ±221,0 ng/ml (ryc. 1). W ciągu miesiąca obserwacji stężenie mioglobiny uległo statystycznie znamiennemu obniżeniu zarówno u pacjentów leczonych standardowo, jak i u oparzonych leczonych dodatkowo preparatem TFX. W 21 i 28 dobie po oparzeniu obserwowano statystycznie znamiennie niski poziom mioglobiny u pacjentów leczonych preparatem TFX w porównaniu do leczonych tylko standardowo.

Stężenie IgG w surowicy krwi
Stężenie immunoglobuliny IgG w surowicy osób zdrowych wynosiło średnio 1205,7 ± 363,9 mg/dl (ryc. 2).

W pierwszej dobie po urazie termicznym średnie stężenie IgG w surowicy wynosiło 935,7 ± 161,9 mg/dl. W siódmej dobie po oparzeniu wartość IgG uległa statystycznie znamiennemu obniżeniu zarówno u pacjentów leczonych standardowo, jak i w przypadku w terapii oparzeniowej preparatem TFX. W kolejnych tygodniach obserwacji stwierdzono statystycznie znamienny wzrost wartości stężeń immunoglobuliny IgG silniej zaznaczony u pacjentów z grupy badanych.

Stężenie IgA w surowicy krwi
Stężenie immunoglobuliny IgA w surowicy krwi zdrowych ludzi wynosiło średnio 256,6 ± 97,1 mg/dl (ryc. 3).

W dniu oparzenia średnie stężenie IgA w surowicy krwi pacjentów wynosiło 221,0 ± 70,4 mg/dl. Podobną wartość tego parametru obserwowano u wszystkich oparzonych w siódmej dobie choroby oparzeniowej. W czternastej dobie po oparzeniu zaobserwowano statystycznie znamienny wzrost średniego stężenia IgA u pacjentów z grupy kontrolnej, natomiast u pa- cjentów leczonych preparatem TFX wzrost stężenia IgA nie wykazywał statystycznej istotności. W kolejnych badaniach przeprowadzonych w 21 i 28 dniu terapii nie zaobserwowano istotnych zmian średniego stężenia immunoglobuliny IgA, stwierdzono jednak nieznacznie wyższe stężenie IgA u pacjentów badanych.

Stężenie IgM w surowicy krwi
Stężenie immunoglobuliny IgM w surowicy krwi osób nieoparzonych wynosiło średnio 135,9 ± 84,2 mg/dl (ryc. 4).

W pierwszej dobie po urazie termicznym stężenie IgM w surowicy pacjentów przyjęło średnią wartość 100,3 ± 23,8 mg/dl. U pacjentów leczonych standardowo poziom tej immunoglobuliny ulegał powolnemu obniżaniu w trakcie trzech pierwszych tygodni obserwacji. U badanych zaobserwowano w siódmej dobie spadek, a następnie w czternastej dobie statystycznie znamienny wzrost wartości średniego stężenia immunoglobuliny IgM w surowicy krwi utrzymujący się na podobnym poziomie przez cały czas trwania badania.

Stężenie czynników przeciwutleniających w surowicy
Średnie stężenie czynników przeciwutleniajacych w surowicy krwi osób nieoparzonych wynosiło 1,39 ± 0,22 mmol/l (ryc. 5).

W dniu oparzenia stwierdzono statystycznie znamienny spadek stężenia antyoksydantów w surowicy krwi chorych; parametr ten przyjął średnią wartość 0,60 ± 0,21 mmol/l. Po tygodniu standardowego leczenia zaobserwowano wzrost średniego stężenia czynników przeciwutleniajacych do wartości 0,73 ± 0,13 mmol/l, utrzymujący się do 14 dnia terapii. U pacjentów badanych zaobserwowano w siódmej dobie spadek, a w czternastej dobie wzrost stężenia antyoksydantów w surowicy krwi. Parametr ten
przyjął odpowiednio wartości 0,53 ± 0,23 mmol/l i 0,68 ± 0,2 mmol/l. W kolejnych badaniach zaobserwowano statystycznie znamienny wzrost średniego stężenia czynników przeciwutleniających w surowicy krwi wszystkich pacjentów, jednak po miesiącu leczenia parametr ten nie osiągnął wartości zbliżonej do poziomu antyoksydantów w surowicy krwi ludzi nieoparzonych.

Aktywność peroksydazy glutationowej w krwinkach czerwonych
Aktywność peroksydazy glutationowej (GSH-Px) w erytrocytach ludzi nieoparzonych miała średnią wartość 16,28 ± 12,36 U/gHb (ryc. 6).

W dniu oparzenia średnia aktywność badanego enzymu uległa nieznacznemu obniżeniu przyjmując wartość 14,14 ± 9,50 U/gHb. U pacjentów grupy kontrolnej po tygodniu terapii aktywność GSH-Px statystycznie znamiennie wzrosła osiągając średnią wartość 22,04 ± 8,73 U/gHb i nie uległa zmianie do 14 doby obserwacji. U pacjentów badanych zaobserwowano również statystycznie znamienny wzrost aktywności badanego enzymu w porównaniu do stanu w dniu oparzenia. Średnia aktywność GSH-Px wynosiła bowiem u tych pacjentów 29,75 ± 17,36 U/gHb.

W badaniach wykonanych zarówno w siódmej, jak i w czternastej dobie choroby wzrost średniej aktywności peroksydazy glutationowej u chorych z grupy badanej wykazywał statystycznie znamienną różnicę w porównaniu do aktywności u pacjentów z grupy kontrolnej. W 21 dobie kuracji aktywność enzymu osiągnęła prawie identyczną wartość w erytrocytach pacjentów z grupy K, jak u pacjentów z grupy E. W 28 dobie obserwacji średnia aktywność peroksydazy glutationowej uległa statystycznemu obniżeniu tylko u pacjentów z grupy kontrolnej natomiast w grupie badanej aktywność badanego enzymu nie uległa istotnej zmianie.

Aktywność katalazy w krwinkach czerwonych
Średnia aktywność katalazy w erytrocytach ludzi nieoparzonych wynosiła 4,92 ± 1,78 U Berg/gHb (ryc. 7).

W pierwszej dobie po urazie termicznym aktywność badanego enzymu statystycznie znamiennie wzrosła przyjmując średnią wartość 6,94 ± 1,84 U Berg/gHb. W siódmej dobie po oparzeniu u pacjentów leczonych standardowo aktywność katalazy uległa statystycznie znamiennemu obniżeniu przyjmując średnią wartość 4,96 ± 2,13 U Berg/gHb. W kolejnych tygodniach obserwacji wartość tego parametru u pacjentów grupy kontrolnej nie uległa zmianom.

U oparzonych z grupy E zaobserwowano w siódmej dobie terapii statystycznie znamienny wzrost aktywności katalazy w porównaniu do wartości tego wskaźnika w dniu oparzenia. Średnia aktywność katalazy wyniosła u tych pacjentów 8,25 ± 1,36 U Berg/gHb. W kolejnych tygodniach trwania badania aktywność katalazy u chorych badanych nie uległa istotnym zmianom utrzymując się na porównywalnie wysokim poziomie.

Dyskusja

Ciężkie i głębokie oparzenia dużej powierzchni ciała powodują powstanie choroby oparzeniowej. W pierwszym okresie tej choroby, zwanym fazą wstrząsu, dochodzi do zaburzeń hemodynamicznych, metabolicznych, a także zaburzeń czynności poszczególnych narządów. Wskutek powstającej kwasicy, fipoksji tkankowej i toksemii uszkodzona zostaje m.in. tkanka mięśniowa. Przejawem tego procesu jest zwiększone stężenie mioglobiny w surowicy krwi. (2, 4, 7)

W niniejszej pracy stwierdzono, że ciężki uraz termiczny powoduje gwałtowny wzrost stężenia mioglobiny w surowicy krwi: poziom mioglobiny określony w dniu oparzenia
osiągnął średnią wartość 813,6 ± 221,0 ng/ml. Wartość ta wielokrotnie przekroczyła zakres normy wynoszący 5-65 ng/ml. W toku poczynionych obserwacji stwierdzono, że stężenie mioglobiny u wszystkich oparzonych pacjentów utrzymywało się na podwyższonym poziomie. Jednak u pacjentów, u których stosowano dodatkowo preparat TFX, w trzecim i czwartym tygodniu kuracji zaobserwowano statystycznie znamienne obniżenie poziomu mioglobiny w surowicy w porównaniu do pacjentów leczonych metodą standardową. Świadczyć to może o zahamowaniu procesu miolizy u tych pacjentów.

Urazy termiczne zaburzają mechanizmy odpornościowe ustroju. Kolejnym oznaczanym parametrem było stężenie immunoglobulin klas G, A i M biorących udział w mechanizmach odporności humoralnej organizmu. Z doniesień z piśmiennictwa wynika, że ciężkie i rozległe oparzenie obniża poziom immunoglobulin IgG, IgA i IgM w surowicy. Wyniki niniejszych badań są zbieżne z tymi doniesieniami. Analiza średniego stężenia immunoglobulin w surowicy pacjentów dokonana w dniu oparzenia wykazała, że zarówno stężenie IgG, IgA, jak i IgM było niższe od wartości tych parametrów u ludzi zdrowych.

W trakcie miesiąca obserwacji stwierdzono, że u pacjentów leczonych dodatkowo preparatem TFX stężenie immunoglobulin wszystkich badanych klas było wyższe niż u chorych leczonych standardowo. Zwraca uwagę podwyższone stężenie immunoglobuliny IgM utrzymujące się przez cały czas trwania leczenia. Immunoglobulina ta cechuje się wysoką aktywnością przeciwbakteryjną i jest charakterystyczna dla pierwotnej odpowiedzi immunologicznej. (8, 9) Stężenie immunoglobuliny IgG w toku terapii grasiczej wykazywało stałą tendencję wzrostową, co może świadczyć o wzmożeniu wtórnej odpowiedzi immunologicznej w kolejnych okresach leczenia choroby oparzeniowej. Zaznaczyć należy, że w grupie pacjentów otrzymujących dodatkowo preparat TFX zaobserwowano statystycznie znamienne skrócenie czasu gojenia ran głębokich i statystycznie istotnie mniejszą liczbę posocznic niż u pacjentów leczonych standardowo.

Bardzo ważnym klinicznym parametrem jest ocena zdolności przeżycia pacjentów po ciężkim urazie termicznym. Wyniki tej pracy udowadniają, że w grupie pacjentów
otrzymujących TFX zanotowano statystycznie znamiennie niską liczbę zgonów. Z powodu wielonarządowej niewydolności wywołanej posocznicą zmarł tylko jeden pacjent. Obserwacje te są zbieżne z doniesieniami z piśmiennictwa. Z prac Czaplickicgo i wsp. wynika, że stosowanie preparatów z dojrzałych grasic Thymex L i TFX-Thymomodulin w terapii ciężkich urazów termicznych zwiększa szansę przeżycia pacjentów.

Według teorii Harmana uszkodzone komórki i tkanki charakteryzują się podwyższonym poziomem wolnych rodników nadtlenkowych odpowiedzialnych za destabilizację błon komórkowych. Czynnik termiczny, a także toksyny bakteryjne wywołują wzrost poziomu wolnych rodników nadtlenkowych w komórkach i tkankach oparzonego organizmu.

Ustrój człowieka wyposażony jest w enzymatyczny i pozaenzymatyczny system antyoksydacyjny. W ostrych stanach chorobowych, gdy dochodzi do nadprodukcji wolnych rodników nadtlenkowych, zmienia się aktywność enzymów oksydacyjnych komórek oraz całkowita pojemność antyoksydacyjna surowicy krwi. U oparzonych pacjentów z obu badanych grup obserwowano obniżenie stężenia czynników przeciwutleniających w surowicy krwi.

W trakcie standardowej terapii choroby oparzeniowej, a także terapii wspomaganej preparatem TFX, poziom antyoksydantów nie osiągnął wartości porównywalnej z wartością tego parametru w surowicy osób zdrowych. Można przypuszczać, że w ciężkich przypadkach choroby oparzeniowej niedobór czynników przeciwutleniających
w surowicy jest tak duży, że organizm nie jest w stanie uzupełnić ich deficytu. Celowe wydaje się rozważenie możliwości dodatkowego uzupełnienia zaistniałych niedoborów poprzez wprowadzenie do leczenia dostępnych egzogennych antyoksydantów, np. alfa-tokoferolu i kwasu askorbinowego. Z przeprowadzonych badań wynika, że aktywność enzymów antyoksydacyjnych krwinek czerwonych: peroksydazy glutationowej i katalazy, ulega zmianie w czasie trwania choroby oparzeniowej. Zwiększona aktywność tych enzymów obserwowana od siódmej doby po oparzeniu może sugerować, że w krwinkach czerwonych ulegają nasileniu enzymatyczne procesy mające chronić erytrocyty przed uszkadzającym wpływem nadtlenku wodoru. Podwyższona aktywność tych enzymów, obserwowana zwłaszcza u oparzonych pacjentów otrzymujących dodatkowo TFX, może sugerować zwiększenie odporności krwinek czerwonych na niekorzystny wpływ produktów reakcji wolnorodnikowych.

Przeanalizowane w niniejszej pracy zmiany zarówno parametrów klinicznych, jak i immunologicznych i enzymatycznych u ciężko oparzonych pacjentów leczonych dodatkowo preparatem z grasicy TFX przemawiają za włączeniem tego preparatu do standardowego leczenia oparzeń.

Piśmiennictwo

1. Aleksandrowicz J, Turowski G, Cybulski L, Szmigiel Z, Skotnicki AB. Immuno-heamatological and clinical response in patients with malignant diseases after repeated administration of thymic extract. Ann Immunol 1975,7:97-98

2. Arturson G. Patophysiology of the burn wound and pharmacological treatment. The Rudi Hermans Lecture. Burns 1996;Vol. 22,Nr 4:225-274

3. Błońska B, CzaplickiJ, Pesić MC, Klementys A, Wiertka P. Do active substances of thymus influence the processes of aging? VIII. Erythrocyte parameters in aging mice treated with embryonal and early fetal thymic calf extracts (ETCE) and mature calf thymic extracts (Thymex L and TFX).
[w:] Thymuspeptide, Thymusenzyme, Thymushormone in Forschung und Therapie. Thymus Medizinischer Fachbuchverlag, Bad Harzburg 1992:139-148

4. Czaplicki J, Błońska B, Klementys A, Machniak M, Pesić MC, Brandys B, Grzybek H, Czarnecki J. Do active substances of thymus influence the processes of aging? II. Liver morphology in aging mice treated with embryonal and early fetal thymic calf extracts (ETCE) and mature calf thymic extracts (Thymex L and TFX). Thymus 1990;15:247-255

5. Czaplicki J, Sakiel S, Błońska B, Klementys A, Klementys K, Uchman M, Czarnecki J. Thymic cxtracts and severe burns: A promissing additional treatment. Internat J Thymology, 1994;Vol.2, No. 4

6. Davies JWL. Physiological responses to burning injury. Academic Press, London 1982

7. Górski A, Skotnicki AB, Gaciong Z, Korczak G. The cffects of calf thymus extract TFX on human and mouse hemopoisis. Thymus 1981;3:129-141

8. Sparkes BG. Immunological responses to thermal injury. Burns 1997;Vol.23,No2:106-113

9. Teodorczyk-Injean JA, Sparkes BG, Falk RE et al. Immunoglobulin production in burned patients. Kinetics and correlation with T-cell activity. Trauma 1986;26:834

10. Wyszyńska Z, Błońska B, Czaplicki J. Próby zastosowania wyciągów embrionalnych i wczesnopłodowych grasic w leczeniu trudno gojących się ubytków skóry. II Owrzodzenia podudzi u ludzi. Przegl. Derm 1987;74:309-315.